การประเมินคุณภาพน้ำเชื้อ (Semen evaluation)

2. การตรวจแบบละเอียดด้วยกล้องจุลทรรศน์
2.1 การตรวจความเคลื่อนไหวของตัวอสุจิ (motility) ควรตรวจที่อุณหภูมิร่างกาย เนื่องจากอุณหภูมิมีผลโดยตรงต่อการเคลื่อนไหวของอสุจิ จึงควรใช้เครื่องอุ่นสไลด์ที่วางอยู่บนแท่นวางวัตถุของกล้องจุลทรรศน์ เพื่อช่วยในการตรวจให้มีอุณหภูมิในช่วง 37-40 องศาเซลเซียส การตรวจการเคลื่อนไหวของอสุจิสามารถประเมินได้ 2 แบบ คือ
2.1.1 โดยการตรวจการเคลื่อนไหวแบบหมู่ (wave motion characteristic) โดยปกติแล้วน้ำเชื้อที่เพิ่งรีดมาใหม่ อสุจิจะมีการเคลื่อนไหวเป็นลักษณะคล้ายคลื่น หรือฝูงลูกปลา โดยดูจากกล้องจุลทรรศน์ที่มีกำลังขยาย 40-100 เท่า วิธีการจะหยดน้ำเชื้อที่รีดมาได้ 1 หยด ลงบนแผ่นสไลด์ที่สะอาด อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ไม่ต้องปิดด้วยกระจก coverslip ในน้ำเชื้อที่มีอสุจิเข้มข้นมากกว่า 300 เซลล์ (หรือตัว) ต่อลูกบาศก์เซนติเมตร จะเห็นตัวอสุจิว่ายวนหมุนเป็นคลื่น สามารถประเมินเป็นคะแนนการเคลื่อนไหวตั้งแต่ 0-5 คะแนน

2.1.2 โดยการตรวจการเคลื่อนไหวแบบตรงไปข้างหน้าโดยสังเกตเป็นรายตัว (proportion of progressive motile sperm) คือ การหาเปอร์เซ็นต์ตัวอสุจิที่เคลื่อนที่ไปข้างหน้าตรงๆ หรือเป็นการสังเกตการณ์เคลื่อนที่เป็นรายตัว ไม่รวมตัวที่เคลื่อนที่เป็นวงกลม เคลื่อนถอยหลัง หรือแกว่งไปมาเหมือนลูกตุ้ม เป็นการตรวจสอบหาสัดส่วนของอสุจิที่ยังคงมีชีวิต ด้วยกล้องจุลทรรศน์กำลังขยาย 400 เท่า โดยการหยดน้ำเชื้อลงบนแผ่นสไลด์ที่สะอาดที่ อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส และปิดด้วยกระจก coverslip อาจจะเจือจางด้วยน้ำยาละลาย หรือน้ำเกลือ เพื่อทำให้มองเห็นเซลล์ได้ง่าย แต่ต้องระมัดระวังไม่ใช้น้ำยาที่มีความเข้มข้นเกินไปจนน้ำซึมออกจากเซลล์ ซึ่งเป็นอันตรายต่อตัวอสุจิ จากนั้นสังเกตและบันทึกอัตราการเคลื่อนที่ตรงไปข้างหน้า โดยสังเกตดูในหลายๆ พื้นที่ของแผ่นสไลด์ แล้วนับให้เป็น 100 ช่อง เช่น นับได้คะแนน 80% หมายถึง ใน 100 ตัวมีตัวอสุจิที่มีชีวิต 80 ตัว น้ำเชื้อที่ดีควรมีอัตราการเคลื่อนไหวรายตัวอย่างน้อย 60%

2.2 การเปรียบเทียบสัดส่วนของอสุจิที่ยังมีชีวิตและที่ตายแล้ว หยุดการเคลื่อนไหว ทำได้โดย การย้อมสีเพื่อแยกอสุจิมีชีวิต และไม่มีชีวิต (differential staining of live and dead sperm) ซึ่งเป็นวิธีการที่นิยม และสะดวก สีที่นิยมใช้ คือ nigrosin – eosin ซึ่ง eosin จะไม่สามารถผ่านเข้าไปสู่ภายในเซลล์ของอสุจิที่มีชีวิตได้ ส่วนอสุจิที่ตายแล้วจะย้อมติดสีชมพูของ eosin ในการย้อมสีนอกจากใช้ 1% eosin แล้วยังใช้สีพื้นเพื่อให้มองเห็นชัดเจน ซึ่งได้แก่ 2% aniline blue หรือ 5% nigrosin เป็นต้น ทำให้พื้นมีสีดำของสีนิโกรซิน (nigrosin)ในการย้อมสีจะใส่สีลงใน 2.9% sodium citrate อุ่นและคนให้เข้ากัน จากนั้นกรองด้วยกระดาษกรองแบบกรองละเอียดปานกลาง เก็บรักษาในตู้เย็น ซึ่งสามารถนำกลับมาใช้ได้อีก นอกจากนี้การใช้เครื่องมือ ที่เรียกว่า เครื่องวิเคราะห์น้ำเชื้อ (photoelectric หรือ semen analyzer) ดูรูปแบบของการว่ายและการมีชีวิตรอดในขณะที่อสุจิผ่านโฟโตทิวป์ (phototube) ก็สามารถวิเคราะห์ผลได้
2.3 การตรวจความเข้มข้นของอสุจิ (sperm concentration) เป็นการนับจำนวนอสุจิที่มีอยู่ในน้ำเชื้อ 1 ลูกบาศก์เซนติเมตร ไม่แยกตัวเป็นตัวตาย สามารถทำได้หลายวิธี เช่น
2.3.1 นับจากฮีโมไซโตมิเตอร์ (haemocytometer) ใช้ชุดตรวจนับเซลล์เม็ดเลือดแดง ซึ่งเป็นปิเปตแก้วขนาดเล็กๆ ตรงกลางเป็นกระเปาะ มีลูกแก้วขนาดเล็กอยู่ภายใน ดูดน้ำเชื้อขึ้นมาถึงขีดกำหนด ให้วงโค้งแตะอยู่ที่ขีดพอดี (0.1 มล.) เช็ดปลายปิเปตให้แห้ง ดูดน้ำยาละลาย (เช่นน้ำเกลือ 4% หรือน้ำกลั่น เพื่อทำให้อสุจิตายหยุดการเคลื่อนไหว และเป็นการเจือจางด้วยสัดส่วนที่สามารถคำนวณกลับได้) เข้าไปในกระเปาะจนถึงขีดที่ใช้วัด (calibrate) (ปริมาตร 9.9 มล.) น้ำเชื้อจะถูกเจือจางเป็น 1:100 ใช้นิ้วหัวแม่มือและนิ้วชี้อุดปลายปิเปตทั้งสองข้าง เขย่าแรงๆ ไม่น้อยกว่า 3 นาที เพื่อทำให้อสุจิกระจายทั่วกัน หยดสองหยดแรกทิ้ง แล้วจึงนำไปใส่ในสไลด์พิเศษสำหรับใช้ในการนับ (counting chamber) ซึ่งมีสเกลแบ่งเป็นตารางเล็กๆ จำนวน 144 ตาราง แต่ละตารางมีปริมาตร 1/250 ลูกบาศก์มิลลิเมตร นับทั้งหมดเพียง 25 ตาราง
การนับจะนับตัวอสุจิที่อยู่ในตาราง และที่แตะอยู่กรอบนอกของสี่เหลี่ยมที่จะนับเพียงสองด้าน นับรวมอสุจิที่มีแต่หัวเข้าไปด้วยแต่ไม่นับหางที่หลุดจากหัว
การคำนวณความเข้มข้นของตัวอสุจิใน 1 ลูกบาศก์มิลลิเมตร เท่ากับ N x S x 250 /A
เมื่อ N = จำนวนอสุจิที่นับทั้งหมด a ตาราง
S = อัตราการเจือจาง
A = จำนวนตารางที่นับ
2.3.2 การประเมินความขุ่นของการผ่านลำแสง (optical density หรือ turbidity) ด้วยเครื่อง spectrophotometer เป็นวิธีที่ง่ายนิยมใช้กันในห้องปฏิบัติการผลิตน้ำเชื้อ จากการผสมน้ำเชื้อ 0.1 มล. ลงในน้ำยาละลาย เช่น 2.9 โซเดียมซิเตรท (sodium citrate) 7.9 มล. นำไปวัดผลการผ่านของแสงที่ความยาวคลื่น (wavelength) 550 มิลลิไมครอน คำนวณหาความเข้มข้นของตัวอสุจิจากกราฟมาตรฐาน วิธีการนี้สามารถใช้กับน้ำเชื้อปศุสัตว์ได้ทุกชนิด แต่ต้องกรองเอาน้ำเชื้อส่วนที่เป็นเจล ออกไปเสียก่อน
2.3.3 เครื่องนับจำนวนตัวเชื้ออัตโนมัติ (electronic particle counter) วิธีการ คือ ละลายน้ำเชื้อด้วยสารละลายน้ำเกลือให้มีสัดส่วน 1:6,000 นำไปผ่านรูเปิดของเครื่องซึ่งมีความดันไฟฟ้า (voltage) เปลี่ยนเป็นความต้านทานไฟฟ้า เกิดเป็นจังหวะความดัน (voltage pulse) และถูกนำไปขยายกำลัง แล้วแปลงค่าเป็นจำนวนตัว
2.4 การตรวจรูปร่างของอสุจิ (sperm cell morphology) ตามปกติในน้ำเชื้อจะมีตัวอสุจิที่มีรูปร่างผิดปกติปะปนมา ประมาณ 5% แต่ถ้าพบว่ามีความผิดปกติเกินกว่า 20% จะทำให้ความสมบูรณ์พันธุ์ลดลง อัตราการผสมติดต่ำลง เทคนิคของการดูรูปร่างของอสุจิ คือ การผสมน้ำเชื้อกับหมึกอินเดียนอิงค์ ที่มีคุณภาพดีลงบนปลายหนึ่งของสไลด์กระจก ทำการ smear ให้น้ำเชื้อกระจายเต็มสไลด์ให้บางๆ โดยใช้สไลด์กระจกอีกแผ่นหนึ่งแตะลงตรงหยดน้ำเชื้อ เอียงทำมุม 30 – 45 องศา ลากไปอีกด้านหนึ่งของแผ่นสไลด์ ให้เกิดฟิล์มบางๆ ทั่วแผ่น การนับอย่างน้อย 100 เซลล์ต่อ 1 ตัวอย่าง หรือทำการแผ่ให้น้ำเชื้อกระจายบางๆ แล้วย้อมด้วยสีวิลเลียม (willium) หรือสีคาร์บอลฟุคชิน (carbol fuchsin) ส่วนความผิดปกติของอะโครโซม (acrosome) ตรวจจากน้ำเชื้อที่ใส่ในฟอล์มอลซาไลน์ (formal saline) แล้วตรวจดูด้วยกล้องจุลทรรศน์ แบบเฟสคอนทราสท์ (phase contrast)